诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是类似胚胎干细胞（ESC）的一种细胞类型,可以通过对已分化的体细胞进行诱导重编程而获得，具有自我更新能力和多能性，可能为多种疾病提供治愈性的医疗解决方案，包括癌症、心血管、代谢、免疫系统和神经系统疾病。然而，在这些潜在转化疗法的开发中，最终产品的质控是其成为“药品”至关重要的一环。本期重点介绍iPSC最终产品的表征分析方法。

常规方法(核型/组织学/碱性磷酸酶)

iPSC的治疗应用取决于iPSC细胞的稳定性和基因组完整性，而遗传不稳定性是长期干细胞培养过程中的一个常见问题。在细胞治疗领域，常规监测基因组完整性和识别严重变异对产品安全至关重要。虽然并非所有的基因组异常都是有害的，但有些变异可能会影响iPSC的分化，并可能导致肿瘤的发生。

核型分析是一种可监测iPSC基因组完整性以及可检测iPSC是否存在染色体畸变的最成熟技术之一，可确保染色体数量和形态在重编程和分化过程中保持完整。

病理生物学检测目前主要依赖于对活检组织进行组织学/细胞学的形态学观察，以及DNA分析，从而从基因水平上检测细胞和组织的分子遗传学变化。然而iPSC需要更精细的技术来破译分子线索、信号转导和准确种群检测。因此需要利用多种技术提供iPSC基因组异常的完整快照。

碱性磷酸酶（AP）在大多数细胞类型中均有表达，但其活性在多能干细胞（PSC）内明显上调，包括未分化的ESC、iPSC 和胚胎生殖细胞 (EGC)。碱性磷酸酶活性染色对细胞无毒性且有助于保持细胞的活力，因此适用于在重编程流程的早期集落筛选，也可在较晚期用于鉴别未分化的细胞。Lonza将这一活性染色法作为GMP条件下表征主细胞库和工作细胞库的标准方法之一。

替代方法（PluriTest，Teratoscore，ScoreCard）

近年iPSC检测领域不断开发出新的替代技术以确定人多能性细胞系的发育潜力，如TeratoScore、 PluriTest以及qPCR ScoreCard。多能性分析 (Affymetrix, Illumina)和RNA-Seq数据结果可进一步用于PluriTest和TeratoScore分析。

TeratoScore是一个在线开放实验平台，可以定量评估人造血干细胞在畸胎瘤中基因表达模式的分化潜力。该算法的理论基础是：畸胎瘤形成是评估hPSC效力(分化为所有三胚层衍生物的能力)的金标准之一。TeratoScore还可以区分肿瘤是来自特定组织还是来自多能细胞。

PluriTest是一个验证和表征干细胞培养物多能性潜力的在线生物信息分析平台，是一种多能性验证的成熟方法。该平台可将测试细胞系的转录组与大量的具有多能性的细胞系转录组进行比较，尽管测试结果不能直接评估待测细胞系的分化能力，但可以排除与未分化干细胞差异较大的细胞。PluriTest还可以在PSC建立早期阶段，对少量细胞进行快速检测。

图：PluriTest工作流程。首先将细胞系的微阵列数据上传到PluriTest网站。PluriTest算法和模型可评估上传样本的Pluripotency Scores 和Novelty Scores，生成结果报告给用户。PluriTest 报告中红色为多能样品，蓝色为非多能样品（数据来源：DOI: 10.3824/stembook.1.84.1）

人们开发了三胚层qPCR实验来表征细胞系，该实验通过检测三胚层标记基因的表达，来评估细胞是否有潜力向三胚层分化，并最终能发展成体内所有的细胞类型。比如Scorecard就是一种qPCR检测方法，可将基因表达分析与生物信息学结合起来，为待检细胞提供了简单、易解读的记分卡。该检测 可快速确认在有/无滋养层条件下生长的hESC和hiPSC细胞系的三胚层分化潜能。

端粒分析方法

端粒的调控、维持和稳态对iPSC的长期培养至关重要，在iPSC重编程过程中，端粒酶激活和端粒长度延长。因此端粒分析可以准确评估干细胞和iPSC的分化潜力，在细胞衍生产品质量相关的体内外研究中是有力的手段。

端粒分析技术(TAT)是一种端粒长度测定法，可测量任何细胞系的端粒中位长度。TAT采用高通量Q-FISH(定量荧光原位杂交)技术。Q-TRAP(Telomeric Repeat Amplification Protocol)可用于评估来自血液淋巴细胞和其他生物样品的全细胞裂解物的端粒酶活性。这两种分析干细胞端粒长度和端粒酶活性的技术可以评估iPSC状态和功能，作为iPSC重编程和分化的软传感器，也可用于筛选具有高度分化潜力的细胞产品批次。文献显示，有研究人员利用端粒分析来区分新鲜解冻的iPSC和15代iPSC。

用于iPSC工业生产的新型分析方法

最近报道了一种新型基于微流控芯片的稀有人造血干细胞定量技术。该方法基于干细胞定量Cytometry，能够在低成本、可制造的微流控芯片中实现对磁性纳米颗粒标记的微量hPSCs进行超灵敏捕获、分析和计数。微流控技术已被用于检测hPSC衍生的心肌细胞中的稀有hPSCs，并且可以扩展到检测其他hPSC衍生产品。

除了利用qPCR方法检测残留iPSC（Lonza）之外，最近还报道了一种使用ddPCR 检测心肌细胞中残留未分化hiPSC的灵敏方法。作者应用ddPCR（LIN28的探针和引物）可显著检测到原代心肌细胞中未分化hiPSC（<0.001%）。这些新技术可以高度准确地分析评估iPSC产品的安全性和特性。

流式细胞术通过荧光标记抗体以定量其细胞表面抗原表达，可用于各种细胞类型ID鉴定，也可提供干细胞产品纯度。基于PCR的技术可用于检测细胞特异性基因，同时也可用于检测干细胞产品的纯度。如前所述，新型的基于PCR的技术(如ddPCR)，可以显著提高iPSC及其衍生物的关键特性（包括有效性与安全性）检测的准确性和有效性。想比较来看，流式细胞术更省时，成本更低，而PCR则更加灵敏。尽管流式细胞术和PCR不能相互替代，但可以在临床试验中互补应用，以优化风险分层。

小结

综上所述，在 iPSC 项目中，无论细胞产品无论是在制备过程中还是其最终产品的放行检测阶段，分析鉴定都很重要，需要密切关注细胞表型、分泌谱、培养异质性和污染颗粒的存在，以确保细胞药物的安全性和有效性。作为CGT CDMO 服务商，宜明生物建立了的一整套成熟完善的iPSC质检体系，可提供iPSC细胞库的无菌性、支原体、内毒素、分化因子残留、细胞活率，遗传稳定性、以及多能性进行检测。11月16日宜明生物董事长兼CTO孙秀莲博士在第三届中国细胞治疗年度大会（苏州）上，分享GMP规范下iPSC产品质量控制的要点，受到与会专家同仁的一致关注。

关于宜明生物Ubri-Psyche iPSC 制备平台

宜明生物是一个CGT药物国际化一站式CDMO 服务平台，通过对iPSC基因编辑技术流程进行全面优化创新，其专有的Ubri-Psyche iPSC 制备平台可为CGT新药企业提供GMP菌种库构建、GMP质粒生产、各类基因编辑元件（spCas9/mRNA、dsDNA、gRNA等）的GMP生产以及IPSC细胞建库等一站式服务。所建立的一整套成熟先进的iPSC质检体系，可提供iPSC细胞库的无菌性、支原体、内毒素、分化因子残留、细胞活率，遗传稳定性、以及多能性进行检测，助力新药企业制造符合国内外生物制药法规标准、且满足国内外生产质量管理规范的细胞药物，造福中国及全球患者。

Ref：

1.doi.org/10.1016/j.btre.2023.e00784

2.DOI: 10.3824/stembook.1.84.1

3.doi.org/10.1016/j.tibtech.2016.05.010

4.doi.org/10.2217/rme-2018-0095

5.人源干细胞产品要学研究与评价技术指导原则（试行）（2023年四月）